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      行业资讯|关于疫苗中Vero传代细胞DNA残留检测技术

      生物制品携带的宿主残留DNA具有传递外源DNA的潜在危害,因此去除宿主DNA,预防可能出现的不利后果是极为必要的。宿主细胞残留DNA作为生物制品安全性评价的一个重要指标,各国药品监督管理机构对其残留量有着严格的限度控制。君研生物自主研发的Vero残留DNA检测试剂盒能快速、特异地检测生物制品中成品,半成品和中间品中DNA残留量。

      多年来,国外已成功的研制了采用Vero细胞生产疫苗并获准上市,包括人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活(纯化)疫苗(IPV),并在中国注册或正在注册申请中。在上世纪九十年代后,国产的采用Vero细胞生产的人用狂犬病纯化疫苗、乙型脑炎纯化疫苗、肾综合征出血热纯化疫苗被批准上市。近年来,又有一些企业申请乙型脑炎纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活(纯化)疫苗、甲型肝炎灭活疫苗进行临床研究或上市。随着采用Vero细胞生产疫苗种类的增多,并且使用人群扩大到婴幼儿,其细胞残留物质越来越受到关注,已成为我们审评中重点考虑的问题之一。

      Vero细胞的正式名称为“非洲绿猴肾细胞”,是传代细胞的一种。所谓传代细胞可简单的理解为,在体外可以连续传代的细胞系,理论上具有无限传代的寿命。传代细胞系可以通过以下方法衍生而来。

      正常细胞群的连续传代,繁衍成一个新的具有无限寿命的细胞群,例如非洲绿猴肾细胞的传代细胞系Vero细胞;人或动物肿瘤细胞的原代细胞的系列培养,例如Hela细胞、Namalva细胞等;携带致癌基因的病毒,将致癌基因转化给正常细胞,成为肿瘤细胞,例如EB病毒转化的B淋巴细胞;骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合,例如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

      由于肿瘤细胞或携带肿瘤基因的细胞具有致肿瘤的危险,所以该类细胞不能作为细胞基质用于疫苗生产;因此用于疫苗生产的细胞系均采用非肿瘤细胞系,即正常细胞群的连续传代后繁衍的细胞系,在一定传代限度内使用,目前使用的Vero细胞属于此类。Vero细胞由于具有传代细胞特性,因此也存在理论上的潜在致肿瘤性。目前WHO认为130~150代细胞无致肿瘤性,可以用于疫苗的生产。目前国内研制的Vero细胞基质的疫苗,细胞致肿瘤试验均为阴性,已批准上市多年的产品,未见有安全性方面的问题。有报导超过170代的Vero细胞致肿瘤试验阳性。

      由于传代细胞调控生长的基因失调,使得传代细胞系具有无限的寿命。因此,理论上认为传代细胞系的DNA具有使其他细胞生长失控和产生致肿瘤活性的潜在能力,因此需对疫苗的Vero细胞残余DNA进行质量控制。传代细胞可分泌生长因子(称促生长蛋白),该生长因子可以促进细胞生长,在异常情况下有致肿瘤作用,并需要持续作用。鉴于目前国际上尚无特异性Vero细胞蛋白的检测手段,现仍以疫苗蛋白总量进行间接质控。

      综上所述,Vero细胞生产疫苗具有理论上的潜在致肿瘤性风险,控制该风险的措施有两个方面,其一为控制Vero细胞的代次在130~150代,其二为降低Vero细胞残余DNA含量、残余蛋白含量(通过总蛋白含量进行间接质控)。目前国际上及国外公司对Vero细胞残余DNA含量、总蛋白含量的控制标准内容为:
      1)WHO的标准比较宽松,无论是否用于婴幼儿的,均控制在≤10ng/剂量;
      2)欧盟相对于WHO,提高了婴幼儿使用疫苗的要求,婴幼儿疫苗≤100pg/剂量,非婴幼儿疫苗≤10ng/剂量;
      3)已知的两国外公司对婴幼儿疫苗更提高了要求,控制在≤10pg/剂量。一家订入规程,一家作为内控标准。
      4)我国上市的狂犬病疫苗≤100pg/剂量,相当于欧盟的婴幼儿使用疫苗的要求。
      5)我国上市的乙型脑炎纯化疫苗(04年上市)使用人群包括婴幼儿,控制在≤10ng/剂量,符合WHO通则、欧盟通则、WHO对婴幼儿疫苗的要求,达不到欧盟对婴幼儿疫苗的要求(≤100pg/剂量),更达不到外企的控制标准(≤10pg/剂量)。
      6)肾综合征出血热纯化疫苗(02年上市)使用人群为成人,控制在≤10ng/剂量, 符合WHO通则、欧盟通则要求。

      关于总蛋白含量,因疫苗(病毒蛋白)的免疫原性不同,每种疫苗不尽相同,国际上对IPV要求为≤10ug/剂量;我国要求狂犬病疫苗≤120ug/剂量;据调研,乙型脑炎的剂量≤10ug蛋白具有较好的免疫原性。在此需指出,无论是WHO、欧盟还是中国药典的要求,均为最低要求,企业需在满足上述相关要求的基础上提高要求并拟定注册标准。

      对于我国企业采用Vero细胞生产疫苗,需按照注册申请的拟定注册标准(参见2004年3月12日刊登在CDE网站的《关于对预防用生物制品注册标准的理解和拟定原则的考虑》),其中包括Vero细胞DNA残余量及总蛋白残余量,建议在拟定注册标准时作如下考虑:

      1. 加强去除细胞DNA和去除杂蛋白(细胞蛋白)的工艺研究,最大限度的降低DNA残余量和总蛋白含量。尤其是用于婴幼儿的疫苗(如IPV、乙型脑炎疫苗等),最好能控制在DNA残余量≤10pg/剂量,总蛋白含量≤10ug/剂量。

      2. 对于达不到DNA残余量≤10pg/剂量,总蛋白含量≤10ug/剂量的产品,不建议在2岁以下婴幼儿人群中使用。

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