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      科研干货

      微生物质控之支原体快速检测方法

      支原体(mycoplasma)是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物,大小为0.1~0.3微米。由于能形成丝状与分枝形状,故称为支原体。

      支原体是实验室中常见的污染源,据统计约有15%-35%的细胞被支原体污染。污染的主要来源有:工作环境污染、操作者本身污染、培养基污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染会改变细胞内DNA、RNA及蛋白表达,改变宿主细胞的结构和功能,影响细胞代谢和生长,具有干扰病毒复制的不利影响。

      相法规及指导原则

      中国药典2020版<3301支原体检查法>:进行支原体检查时,应同时进行培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。
      日本药典(JP)14:提供三种检测方法:1)培养法;2)指示细胞培养法;3)PCR法。
      欧洲药典(EP)2.6.7及美国药典(USP)<63>:提供三种检测方法:1)琼脂和肉汤培养法;2)指示细胞培养法;3)核酸扩增技术(NAT)。(经过评估后需与前两种方法有可比性,才可作为替代方法)
      FDA:提出对于原材料、病毒种子、未加工的收获液等都需要进行支原体控制。
      ICHQ5D:提出对于原材料、病毒种子、未加工的收获液等都需要进行支原体控制。
      免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则(试行):对微生物污染和微生物代谢产物/衍生物污染的安全性研究,如真菌、细菌、支原体、病毒、内毒素等进行安全性研究。
      细胞治疗产品申请临床试验药学研究和申报资料的考虑要点:病毒和细胞的载体质量标准应包括支原体等。部分支原体种类对人和动物有致病性,存在一定的生物安全风险,因此,支原体检验也是生物制品行业规定的必检项目。
      培养法和指示细胞法在实际应用中,存在检测周期较长的缺点,不满足有效期短的产品或需要快速放行的中间品。君研生物为了寻求既满足法规检测需求,又快速方便的检测方式,开发了支原体检测试剂盒。

      支原体DNA(qPCR)检测试剂盒

      君研生物自主研发的支原体DNA(qPCR)检测试剂盒M0311A-50专一性强,灵敏度高,可用于定性检测主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞中是否存在支原体污染,可与君研生物“宿主细胞残留DNA(磁珠法)样本前处理试剂盒”以及全自动核酸提取仪配套使用。本试剂盒的优势在于可覆盖150多种支原体检测,检测限、精密度、耐用性好、专属性强。

      产品性能参数

      检测限

      对10种标准菌株(10CFU/mL)分别做24次提取并检测,检出率达100%。

      空白限

      DNA稀释液进行24次检测,同时将DNA稀释液进行24次提取并检测,结果显示FAM通道Ct值≥40或扩增曲线无明显起峰,CY5通道Ct值<40且有明显扩增曲线。

      精密度

      将阳性样本重复10次检测,FAM通道和CY5通道CtCV<5%。

      专属性

      1.将PBS、10%胎牛血清、10%马血清、支原体肉汤培养基、精氨酸支原体肉汤培养基、NK培养基、CHO无血清培养基、DMEM培养基等作为样本进行提取检测,检测结果显示FAM通道Ct值≥40或扩增曲线无明显起峰,CY5通道Ct值<40且有明显扩增曲线,对支原体DNAqPCR)检测试剂盒无干扰。

      2.将常见生物制品(例如:CHO、E.coli、毕赤酵母、MDCK、PG13、Vero等)300pg/μL基因组DNA,其他工程菌乳杆菌(发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌等)、链球菌(嗜热链球菌、酿脓链球菌等)、梭菌(丁酸梭菌、生孢梭菌等)作为样本进行提取检测,检测结果显示FAM通道Ct值≥40或扩增曲线无明显起峰,CY5通道Ct值<40且有明显扩增曲线,对支原体DNAqPCR)检测试剂盒无交叉反应。

      耐用性


      1.支原体标准菌株在不同稀释基质(如DMEM培养基、CHO无血清培养基等)、产品冻融,产品运输、多种机型改变(如ABI7500,Bio-RadCFXOpus96,RocheLightCycler96等)情况下均可以稳定检出。

      2.经验证,106细胞数的SIHA细胞、HCC827细胞和干细胞、5%人血白蛋白和1mg/mL的质粒DNA等样本基质不影响支原体DNA(qPCR)检测试剂盒和宿主细胞残留DNA(磁珠法)样本前处理试剂盒的提取与检测。

      联合验证

      与第三方机构合作,在欧洲药典指导下,用培养法、指示细胞培养法和qPCR的同步实验分别检测10CFU/mL、100CFU/mL的口腔支原体和肺炎支原体,进行可比性研究。结果显示100CFU/mL的口腔支原体和肺炎支原体指示细胞法检测为阳性;10CFU/mL和100CFU/mL的口腔支原体、肺炎支原体培养法及支原体DNA(qPCR)检测试剂盒检测均为阳性,三种检测方法具有可比性。


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